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實(shí)驗(yàn)常見問題分析與解決方案

上海金鵬分析儀器有限公司針對(duì)WB做不好的常見問題分析與解決方案：
問題 可能原因 驗(yàn)證或解決辦法
 
 
 
 
 
背景較高		 封閉不充分 延長(zhǎng)封閉時(shí)間，更換合適的封閉劑(脫脂奶粉，BSA,血清等)
一抗?jié)舛冗^高 增加一抗稀釋倍數(shù)，
抗體孵育溫度過偏高 建議4℃孵育
二抗非特異性結(jié)合
或與封閉劑交叉反應(yīng)		 設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?/td>
一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng) 在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng).
洗膜不充分 增加洗滌次數(shù)
膜不合適 NC膜比PVDF膜背景低
膜干燥 保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
沒有陽性條帶 或很弱		  
一抗、二抗等不匹配		 訂購試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬， 一抗與二抗或/和底物與酶 系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物?？赏ㄟ^設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè) 系統(tǒng)的有效性。
-抗或/和二抗?jié)舛鹊?/td> 增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間
封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng) 封閉時(shí)使用溫和的去污劑，如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的 脫脂奶、BSA、血清或明膠
一抗不識(shí)別目的物種的靶蛋白 檢查說明書，或做ClustalW比對(duì)，設(shè)陽性對(duì)照
樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過 低(抗原無效) 設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔   20-30ug蛋白，樣本制備時(shí)使用蛋白酶抑制劑，或分級(jí)提取目的蛋白。
轉(zhuǎn)膜不充分，或洗膜過度 使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿 過度洗膜
過度封閉 使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少 封閉時(shí)間
一抗失效 使用有效期內(nèi)抗體，分裝保存，避免反復(fù)凍融取用，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用
二抗受疊氮鈉抑制 所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
酶和底物失效 直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了、選擇在有 效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物，使用新鮮的底物.
曝光時(shí)間過短 延長(zhǎng)曝光時(shí)間
 
 
 
 
 
 
多非特異性條 帶
或條帶位置不 對(duì)		 細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表 達(dá)模式的分化 使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實(shí)驗(yàn)
體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修 飾形式：乙?；?、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等  
查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小
蛋白樣本降解 使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑
新蛋白或同族蛋白的分享同種表 位的不同剪接方式 查其它文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說明書報(bào)導(dǎo)的細(xì)胞株或組織
一抗?jié)舛冗^高 降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異性結(jié)合 降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照
選擇特異性更強(qiáng)，只針對(duì)重鏈的二抗
抗體未純化 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
蛋白存在二聚體或多聚體 SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min,
 
 
 
    以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性
背景有白色/黑 色斑點(diǎn) 轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均 盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)
抗體與封閉劑結(jié)合 過濾封閉劑
暗片現(xiàn)白條帶 一抗或二抗加入過多 稀釋抗體的濃度
目的條帶過低/ 過高 SDS-PAGE膠濃度選擇不合適 調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃 度膠
“微笑”條帶 遷移過快，電泳溫度過高 降低電泳速度，低溫電泳(冷室)
 
 
 
 
轉(zhuǎn)膜不充分		 膜沒有完全均勻濕透 使用100%methanol漫透膜
靶蛋白分子量小于10,000 選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間
靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩 沖液pH值 |可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH10.5)或使用低pH值緩 沖液如乙酸緩沖液
 
甲醇濃度過高		 過高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同
時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇 濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠Thick gel 對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間
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